背景说明

两个荧光分子（供体Donor和受体Acceptor）足够靠近时，供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，该电子在回到基态前，通过分子间的电偶极相互作用向邻近的受体分子转移，导致供体荧光淬灭，受体荧光增强（或敏化发射）。FRET的产生必须具备3个条件：① 供体的发射光谱和受体的吸收光谱部分重叠（＞30％）。② 供体分子与受体分子的作用距离通常＜10 nm。③ 供体与受体的偶极矩方向需有一定相关性。

图1 FRET的原理机制（Choi et al., 2021）。

服务内容及说明

应用范围

1、蛋白酶活性检测：设计含蛋白酶切割位点的FRET探针（供体-受体通过酶切序列连接），酶活性导致探针断裂，FRET信号消失。

2、蛋白-蛋白互作检测：互作蛋白分别标记供/受体荧光蛋白，二者结合时FRET信号增强。

3、生物传感器开发：将FRET探针与感应元件（如离子结合域、代谢物结合蛋白）融合，靶分子结合引发构象变化，FRET效率改变。

4、药物活性跟踪和检测：药物干扰靶蛋白互作或构象时，FRET信号变化反映药效。

5、蛋白-核酸互作检测：蛋白与核酸（DNA/RNA）结合时，标记的FRET对距离变化导致信号改变。

6、蛋白构象空间变化检测：蛋白构象变化（如折叠、变构）改变供体-受体距离，FRET效率相应变化。

技术流程

以荧光蛋白CFP（供体）和YFP（受体）为例，检测蛋白A和B在细胞内的相互作用情况。

1、载体构建：将待检测的蛋白A和B分别与荧光蛋白CFP和YFP偶联，构建融合蛋白表达载体，并命名为CFP-A和YFP-B。

2、细胞培养与转染：根据实验需求培养特定类型细胞。将表达质粒共转染至细胞中进行后续检测。一般分组为A-CFP + YFP；CFP + B-YFP；A-CFP + B-YFP。

3、FRET检测：表达质粒转染细胞后，分别在10 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h和72 h进行荧光检测，确定最适的荧光图像采集时间。

4、FRET图像采集：确定FRET配对的激发波长，蓝光被调谐分别用于探测最大和最小的供体和受体信号对应的波长用于收集双表达细胞的FRET信号。调整激光变化，以便获取最大CFP信号和最小YFP信号的激发光波长，采集供体和受体图像，并收集FRET信号。为保证结果的准确性，每个细胞重复进行3次FRET检测，每组样本至少完成6个细胞的FRET检测。

5、数据处理：去除FRET信号中的光谱串色信号，如供体的直接激发（DSBT）和受体的直接激发（ASBT），对受体通路的FRET信号进行供体和受体光谱灵敏度、自发荧光和光学噪声的矫正，利用矫正系数对双标记细胞进行像素匹配矫正，进而分析蛋白A和B在细胞内的互作情况。

技术优势

1、纳米级空间分辨率：精准反映10 nm范围内的分子互作。

2、实时动态监测能力：活细胞正常生理状态下检测分子间的相互作用和构象变化。

3、高灵敏度与特异性：可实现单细胞检测，单个分子的构象变化；光谱矫正显著降低非特异性信号。

4、多仪器或技术联用：例如显微镜、色谱技术、电泳以及流式细胞技术等，提供多样化的研究手段。

客户下单及项目信息填写

在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录，请客户按照页面提示填写：细胞名称、培养方式、转染要求、载体信息、抗性筛选等信息，细胞及载体可选自行提供或我司提供。

实验信息

实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。

实验周期

致电详询

实验交付内容

1、生物材料实体：重组载体，一份质粒和一份大肠杆菌菌液（25%甘油菌）；

2、载体信息文件：重组载体全序列信息、注释信息、酶切图谱以及测序结果。

3、专项分析报告：FRET组合图及FRET转移效率统计图，完整的实验原始数据及实验报告，包括实验过程、实验试剂与设备信息等。

我司案例

图A显示人源蛋白A和B在BT549细胞中的FRET现象，荧光共振能量转移效率均值为11.61%，表明A和B在BT549细胞中存在一定的弱互作；图B显示A和B在MDA-MB-231细胞中的FRET现象，荧光共振能量转移效率均值为13.22%，表明A和B在BT549细胞中存在一定的弱互作。

图2 A蛋白和B蛋白在BT549细胞（A）和MDA-MB-231细胞（B）中的FRET现象

Donor Emission with Donor Alone（Dd）：指单独供体的发射荧光强度；Donor Emission with Acceptor Present（Da）：指存在受体时供体的发射荧光强度；Acceptor Emission with Donor Alone（Ad）：指单独供体时受体的发射荧光强度；Acceptor Emission with Acceptor Present（Aa）：指存在受体时受体的发射荧光强度；corr FRET：校正因子；FRET eff：荧光共振能量转移效率。

参考文献

[1] Choi JH, Ha T, Shin M, Lee SN, Choi JW. Nanomaterial-Based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) and Metal-Enhanced Fluorescence (MEF) to Detect Nucleic Acid in Cancer Diagnosis. Biomedicines. 2021;9(8):928.