背景说明

 在机体内，ROS的主要来源之一是线粒体内膜的呼吸链底物端，在线粒体中的电子传递链复合物将电子传递给O₂的过程中，有一部分O₂被还原，形成O₂^-或H₂O₂。其中，最为重要的是O₂^-，它是大部分的ROS的前体，主要由线粒体内膜呼吸链中的蛋白酶复合体Ⅰ、Ⅲ产生。另一个ROS的重要来源是NADPH化酶，其催化亚基被称为NADPH氧化酶2（NADPHoxidase2，NOX2/gp91^phax），能够在细胞质膜上表达。这些酶能通过质传递电子产生ROS，可以大量存在于吞噬细胞，也在其他各种组织细胞中以较低水平普遍存在，参与很多膜受体下游信号激活。

图  ROS主要来源（Arfin S et al., 2021）。

 正常情况下，ROS作为氧代谢的天然副产物，在机体内处于较低的水平，作为“氧化还原信使”参与细胞内的信号传递和调节，并且在细胞周期、基因表达和机体内环境稳态的维持中发挥着重要作用。然而，当机体受到刺激时，如紫外线、辐射、缺氧、热暴露等，ROS水平会急剧增加，超过机体本身的清除处理能力，机体氧化-抗氧化作用失衡，发生氧化应激，从而导致DNA损伤，脂质过氧化，蛋白结构和功能发生改变，最终引起机体细胞的死亡。此外，这些大分子物质的损伤还与癌症、衰老、炎症和多种人类疾病（神经退行性疾病、心血管疾病和糖尿病）等的发病机制有关。

 ROS水平是细胞正常生理功能和环境因素导致的细胞氧化损伤的重要标志，因此，非常有必要对ROS的浓度或相对水平进行可靠的测量，检测细胞内ROS水平对于理解细胞信号转导和研究疾病潜在作用机制具有重要意义。

目前常用的ROS检测方法是荧光染色法，即使用DCFH-DA探针进行检测。我司使用的也是此种方法。该方法的检测原理是：DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不会穿过细胞膜，因此积聚在细胞内。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，其绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，使用荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等可以检测荧光信号。

图 DCFH-DA探针在细胞内的作用机制（Rajneesh et al., 2017）。

服务内容及说明

适用范围

ROS水平是细胞正常生理功能和环境因素导致的细胞氧化损伤的重要标志。

1、一般只适用于哺乳动物细胞的检测，活细胞或活体的活性氧检测；

2、不适合血清或组织匀浆液ROS的检测，新鲜的组织样本制备成单细胞悬液可以尝试；

3、植物或细菌，可以在制备原生质体后进行检测使用；

4、不能检测体内的ROS；

5、正常细胞活性氧含量很低，检测效果不好。

客户下单及项目信息填写

在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录，请客户按照页面提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式，提交项目所需要的具体信息，包括：

1、细胞类型与名称；

2、检测时间节点；

3、细胞处理方式及实验条件参数设置；

4、尽可能丰富的相关资料、文献。

客户注意事项

1.标本收集与保存

组织样品：新鲜组织放入液氮或-80℃保存，组织不少于100mg（约绿豆大小）；

培养细胞：不少于2×10⁶个细胞每EP管，加入0.5mL生理盐水或蛋白保护剂，混匀后保存于冰箱（-80℃，避免反复冻融）；

血液细胞标本：以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5mL生理盐水或蛋白保护剂，保存（-80℃可长期保存，避免反复冻融）；

血清或细胞培养液标本：离心去掉杂质后取上清于EP管，保存（4℃以上可保存15-20天，-80℃可长期保存，避免反复冻融）。

2.样本运输：可选以下任何一种方式寄送标本

组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后加冰袋运输；

细胞样本也可以直接快件寄送培养瓶（密封保证不污染，培养液不漏出，细胞不要长得太满，50%左右，灌满培养液）；

血清或上清液直接加冰袋寄送（密封保证液体不漏出，视路途远近2-3天可到达）。

实验信息

实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。

实验周期

致电详询

实验交付内容

1、所有实验的原始数据（包括实验过程、实验试剂与设备等）；

2、实验剩余药物、试剂等；

3、检测报告与结果分析（下机数据、荧光图或流式检测图、结果统计分析等）。

参考文献

Arfin S, Jha NK, Jha SK, et al. Oxidative Stress in Cancer Cell Metabolism. Antioxidants (Basel). 2021;10(5):642. Published 2021 Apr 22.

Rajneesh, Pathak J , Chatterjee A , et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA)[J]. Bio-Protocol, 2017, 7:2545.