背景说明
通过基因工程或化学手段将目标蛋白与具有邻近标记功能的酶（一般为生物素连接酶或过氧化物酶）融合表达。在活细胞或特定条件下激活酶的活性，使其催化标记底物（如生物素Biotin）共价结合到邻近的内源蛋白上，最后通过亲和素磁珠富集带有标记的蛋白并进行质谱（MS）鉴定，分析目的蛋白的互作或邻近的蛋白信息。
图1 邻近标记技术原理（Qin W et al., 2021）。
目前，用于接近标记的酶主要有两种：生物素连接酶（BioID、BioID2、TurboID、miniTurbo等）和过氧化物酶（HRP、APEX、APEX2等）。
1、生物素连接酶
2012年，Roux等人开发出了第一个使用生物素连接酶的邻近标记技术，称为BioID。BioID依赖ATP活性，将邻近蛋白质的赖氨酸残基生物素化。该酶简单无毒，但其催化效率较低，标记时间较长（16-18 h），可能会影响瞬时互作蛋白的标记导致假阳性或假阴性结果。因此，2018年，Branon等人开发出两种新的生物素连接酶TurboID（35 kDa）和miniTurbo（28 kDa），显著提高了催化效率，标记时间缩短在10分钟左右，且可在室温（25°C）下实现有效的生物素化。
2、过氧化物酶
抗坏血酸过氧化物酶APEX经H₂O₂氧化激活生成高活性中间体，能够将底物中的生物素-苯酚（Biotin-phenol，BP）转化为生物素-苯氧基自由基，随后共价标记邻近的蛋白质，主要靶向酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸等富电子氨基酸。2015年，Lam等人对APEX进行了定向改进，研发出了APEX2。APEX/APEX2虽然具有较高的催化效率，但其作用底物H₂O₂易对细胞产生毒性，引起细胞或组织的氧化应激。
3、优化的邻近标记酶
除上述邻近标记酶之外，近些年科学家们也陆续优化并开发出了许多其他的邻近标记酶及标记技术，例如BioID系列的优化酶BioID2、AirID、BASU等，以及小范围使用的邻近标记技术如HRP、EXCELL、PUP-IT、NEDDylation，这些工具酶和技术的开发拓宽了邻近标记技术的应用范围。
表 不同邻近标记酶的特点
服务内容及说明
应用范围
1、检测外泌体互作蛋白：在外泌体膜或内容物蛋白上融合邻近标记酶，分泌后与外泌体互作的细胞表面或胞内蛋白被生物素标记，通过链霉亲和素富集后质谱鉴定。
2、检测蛋白瞬时互作：标记酶与目标蛋白融合，短暂激活后，标记邻近的瞬时结合蛋白。
3、检测膜蛋白互作：在膜蛋白如受体、通道上融合邻近标记酶，标记其邻近的膜或胞内蛋白，解决膜蛋白难溶解、低丰度导致的Co-IP失败问题。
4、检测蛋白弱互作：生物素标记的共价特性可稳定弱互作，避免复合物解离，通过累积生物素标记增强检测灵敏度。
技术流程
根据实验需求选择合适的邻近标记酶系统，确定反应底物浓度、孵育温度以及标记时间。以生物素连接酶TurboID为例，邻近标记技术流程如下：
1、载体构建：将邻近标记酶TurboID与目的蛋白融合表达，加入标签蛋白（如GFP、YFP、HA或His）以便后续鉴定。
2、细胞培养与转染：根据实验要求培养特定细胞类型，将表达质粒转染至细胞系。设置对照组和处理组，对照组为不含目的基因的质粒表达，处理组为上述融合蛋白的表达。
3、蛋白表达测试：Western blot检测融合表达质粒的表达效果。
4、生物素标记：向培养基中加入生物素孵育，TurboID被激活后催化邻近的蛋白质标记生物素。
5、免疫共沉淀（IP）：收集细胞并提取总蛋白，利用链霉亲和素磁珠富集并洗脱生物素标记的蛋白。
6、Western blot检测和质谱分析：WB检测已知可能与目的蛋白相互作用的蛋白，或利用质谱分析生物素标记的蛋白类型。
技术优势
1、生理状态的原位标记：能够直接在细胞或组织中进行标记，保留分子互作的天然状态。
2、动态互作捕获：记录随时间变化的瞬时/弱相互作用，适用于研究动态生物学过程。
3、高灵敏度及低丰度蛋白检测：邻近标记酶催化标记，即使是低丰度蛋白也能被富集检测，且不依赖IP级别抗体和体外蛋白的纯化。
4、高空间分辨率：特异性标记邻近分子（10-20 nm），定位标记酶解析特定亚细胞区域的蛋白质组。
客户下单及项目信息填写
在我司官网http://plant.biorun.com/进行注册或登录，请客户按照页面提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式，提交项目所需要的具体信息，包括：
1、样品来源、含量、状态及其他基本信息；
2、尽可能丰富的相关资料、文献。
实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。
实验周期
致电详询
实验交付内容
1、生物材料实体：重组载体，一份质粒、一份大肠杆菌菌液（25%甘油菌）；
2、载体信息文件：重组载体的全序列信息、注释信息、酶切图谱及测序结果。
3、专项分析报告：完整的检测报告及分析结果，包括蛋白样品检测报告、Western blot实验结果检测或质谱数据、结果统计分析等；以及完整的实验原始数据及实验报告，包括实验过程、实验试剂与设备信息等。
我司案例
在HEK 293T细胞中，运用邻近标记技术寻找AZGP1的互作蛋白。左边图为IP后，WB验证到了诱饵蛋白AZGP1的存在，右图为质谱检测的部分结果。
图2 邻近标记技术筛选AZGP1的互作蛋白
参考文献
[1] Branon TC, Bosch JA, Sanchez AD, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol, 2018;36(9):880-887.
[2] Roux K J, Kim D I, Raida M, et al. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells[J]. Journal of cell biology, 2012, 196(6): 801-810.
[3] Qin W, Cho K F, Cavanagh P E, et al. Deciphering molecular interactions by proximity labeling[J].Nature Methods, 2021, 18(2): 133-143.
[4] Lam SS, Martell JD, Kamer KJ, et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods, 2015;12(1):51-54.
