背景说明

CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ Cas）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统，此系统是由II类CRISPR/Cas系统改造而来，能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中进行有效的靶向编辑，具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。

CRISPR/Cas9技术包含两种重要的组分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的gRNA。CRISPR/Cas9的技术原理包括gRNA引导的Cas9靶向DNA切割和DNA修复两个基本过程。首先，Cas9蛋白特异性切割目标DNA序列，产生DNA双链断裂。Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9蛋白要成功识别目标序列必须满足两个条件：（1）gRNA的5'端20 nt和靶DNA之间碱基配对；（2）靶DNA的3'端有合适的PAM序列（PAM是cas9的特异性识别位点，cas9会在PAM上游的第三个碱基处进行切割）。

CRISPR/Cas9系统中sgRNA识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂，机体自身通过非同源重组的方式修复DSB，参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基，修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失，从而实现机体内的基因敲除。

首先设计能与目标基因特定位点结合的引导RNA（gRNA），并将其与Cas9核酸酶编码序列构建到表达载体上。将该载体导入细胞后，gRNA引导Cas9定位到目标位点，Cas9使DNA双链断裂。细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）修复断裂DNA。利用NHEJ的不精确性可引入随机突变，而提供修复模板（含突变序列）时可借助HDR实现精准突变，从而在特定位点完成定点突变，构建出携带期望突变的细胞系。

图 定点突变细胞系构建

服务内容及说明

适用范围

1、探索基因功能；

2、了解疾病机制；

3、助力药物研发。

客户下单及项目信息填写

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实验信息

实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。

实验周期

致电详询

实验交付内容

1、定点突变的细胞系（多克隆/单克隆）；

2、完整的实验数据及实验报告；

3、所有实验材料免费保存1个月，继续保存请提前沟通，需额外收费，否则逾期自动清理。