背景说明
研究基因的功能，科研工作者通常从两方面着手：功能获得性和功能丧失性。而RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术就是功能丧失性研究的一种，即一段短双链RNA引起的基因沉默现象，1998年，Andrew Z. Fire等在实验中发现，单独使用纯化的正义RNA链或者反义RNA，不能导致秀丽隐杆线虫的肌肉抽搐，作为对照加入的双链RNA则具有极强的抽搐效果。加入的双链RNA的抑制效果远强于理论上1:1配对时的反义RNA的抑制效果，这种现象被命名为RNAi。2006年，Andrew Z. Fire与Craig C. Mello博士由于在RNAi机制研究中的贡献而获得诺贝尔生理及医学奖。而RNAi研究的主角就是siRNA和shRNA。
siRNA
siRNA（small interfering RNA）即小干扰RNA，是20-25nt的双链RNA复合物，每条链的3’端有2-3个突出的非配对碱基，且3’端为羟基，5’端为磷酸，这个结构具有被RnaseⅢ核酸酶识别切割的特征，从而引发高度保守的Dicer家族的RNaseⅢ的识别作用进而特异切割dsRNA产生基因沉默作用。
图 siRNA结构，每条链的3’端均有两个游离碱基
siRNA获取方法
1、体外化学合成法（常用）：设计特异性靶点后，以化学合成方式直接合成，可按需进行特殊化学修饰；
2、体外转录法：以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs；
3、RNase III消化长片断双链RNA法：以200-1000bp靶mRNA为模版，用体外转录方法制备长片断双链dsRNA，用RNase III（或Dicer）酶进行体外消化，得到混合siRNAs，去除未被消化的dsRNA。
shRNA
小/短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），是一种依赖茎环序列产生的短双链RNA结构（19-25nt），实际上是通过载体构建在体内获取siRNA的一种方式，亦可通过RNAi途径调控目标基因。
图 shRNA结构，由正义链和反义链通过环状序列（loop）组成
原理简介
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA，宿主细胞在对其迅即产生反应时，胞质中的核酸内切酶Dicer将其切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA，即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链，其中反义链siRNA与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。
RISC具有核酸酶功能，可在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。切割后，断裂的mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
图 shRNA与siRNA调控基因的原理图
siRNA与shRNA比较
|
比较项 |
siRNA |
shRNA |
|
导入体外细胞难易程度 |
中（依细胞类型而定) |
易（病毒载体） |
|
导入动物体内难易程度 |
低（受组织特异性影响） |
易（病毒载体） |
|
导入方式 |
化学试剂转染 |
化学试剂转染、病毒载体感染 |
|
作用时效 |
短（96h以内） |
可筛稳转细胞系 |
|
稳定性 |
低，易降解，寿命短 |
高 |
|
可控表达程度 |
低（无法诱导沉默） |
高（更换启动子） |
|
结合RISC复合物能力 |
弱 |
强（高于siRNA的10倍） |
|
达到沉默效果所需拷贝数 |
高 |
低（5个左右即可） |
|
脱靶率 |
高 |
低 |
|
化学修饰 |
易修饰，可改善脱靶率 |
无法修饰 |
|
机体免疫反应 |
中 |
弱 |
|
细胞毒性 |
中 |
弱 |
|
体内外安全性 |
高 |
高 |
|
临床安全性 |
中 |
中 |
我司shRNA载体介绍
在哺乳动物体系中，我司目前主要使用商品化pSilencer-U6-Puro载体，其含有U6启动子来启动转录单元的转录，载体上携带氨苄（Amp）原核抗性和嘌呤霉素（Puro）真核筛选标记。我司可针对您的目的基因序列，设计3条及以上siRNAs，经敲低效率验证后，选择敲低效率最高的siRNA连入载体，获得重组载体。
图 原始商品化shRNA载体
服务内容及说明
适用范围
进行基因功能的研究，降低目标基因的表达水平。但需注意，一般RNAi引起的基因沉默会下调基因表达，但不能彻底使其失活，如需使基因彻底失活，建议使用基因编辑的方法。
客户下单及项目信息填写
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录，请客户按照页面提示填写：目的基因信息、载体构建详情，后续转染的细胞可选自行提供或我司提供。
实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。
实验周期
致电详询
实验交付内容
1、所有实验的原始数据（包括实验过程、实验试剂与设备等）；
2、 3-5条合成的siRNA及对照；
3、siRNA序列信息和注释信息（包括序列、化学修饰等）；
4、重组shRNA载体：一份质粒、一份大肠杆菌菌液（25%甘油菌）；
5、重组载体的全序列信息和注释信息；
6、重组载体的酶切图谱；
7、重组载体的测序结果；
8、后续所有实验的相关结果（靶点三包一至少有效果）。
参考文献
Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., et al., (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391(6669), 806–811.
Makinen, P.I., J.K. Koponen, A.M. Karkkainen, et al., Stable RNA interference: comparison of U6 and H1 promoters in endothelial cells and in mouse brain. J Gene Med, 2006. 8(4): p. 433-41.
