背景说明

邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）是一种基于抗体识别与DNA扩增的高灵敏度蛋白质检测技术，其核心原理是通过空间邻近依赖的DNA连接与扩增，将蛋白质相互作用或翻译后修饰事件转化为可定量的荧光信号。具体原理可分为以下关键步骤：

（1）双抗体识别：使用一对特异性抗体（分别针对目标蛋白A和B，或同一蛋白的不同修饰位点），抗体分别偶联一条独特的单链DNA探针（PLUS和MINUS探针）。当两个靶标在空间上邻近（< 40 nm）时，其携带的DNA探针末端得以靠近；

（2）DNA连接与环化：探针末端的互补序列在连接酶催化下共价结合，形成闭环DNA模板。这一步骤具有高度特异性，当两靶标真实互作时才会触发。

（3）信号放大与检测：闭环DNA通过滚环扩增（RCA）生成包含数百重复单元的DNA产物，再与荧光标记或酶标探针杂交，形成离散的荧光信号点（每点代表单个互作事件）。这种指数级信号放大使PLA可检测单分子水平的目标蛋白。

图 邻位连接技术（PLA）原理（Wang et al., 2015）。

服务内容及说明

适用范围

1、检测细胞或组织中的蛋白弱互作：PLA技术通过DNA信号放大可检测传统方法难以捕获的低亲和力或瞬时蛋白互作（如激酶-底物结合、信号通路的短暂激活）。

2、检测细胞或组织中的蛋白翻译后修饰：利用双抗体策略（一抗识别目标蛋白，另一抗识别修饰位点，如磷酸化、泛素化）实现PTM的原位可视化。

3、定位蛋白互作的发生区域：结合其它细胞器marker及免疫荧光技术，可定位蛋白互作的发生位置。

4、临床病理诊断：用于肿瘤分子分型（如EGFR磷酸化激活状态）和免疫治疗生物标志物检测；

技术优势

1、超高灵敏度

滚环扩增实现信号放大1000倍，可解析 < 40 nm范围内的蛋白弱互作，完美适配低丰度蛋白互作研究。

2、原位捕捉蛋白互作

直接在细胞/组织原位捕获互作事件，保留亚细胞定位信息（如膜受体簇集、核内修饰位点），分辨率达40 nm。

3、高特异性

需双抗体 + 双DNA探针同时结合靶标（距离 < 40 nm）才能触发信号，有效规避抗体非特异性吸附导致的假阳性，尤其适合复杂样本（如肿瘤微环境分析）。

4、样本友好

适用于多种样本，如FFPE组织、穿刺活检等微量样本，可兼容IF/FISH等其他标记技术，为精准医疗提供分子病理新工具。

实验流程

（1）样本处理：用多聚甲醛固定处理好的细胞爬片。

（2）封闭：将封闭液滴加到细胞爬片，确保封闭液均匀覆盖整个组织区域。

（3）孵育一抗：将稀释好的一抗均匀滴加在已封闭的细胞爬片，放入湿盒中，37 °C孵育，使一抗与抗原充分结合。

（4）孵育PLA探针：再次清洗后加入PLUS和MINUS两种PLA探针。

（5）连接反应：滴加连接缓冲液（含连接酶），将载玻片置于预热的湿盒中，37 °C下进行连接反应。

（6）扩增及成像：清洗掉连接缓冲液，加入扩增缓冲液（含聚合酶）并使用荧光显微镜观察两个目的蛋白之间的相互作用情况。

客户下单及项目信息填写

在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录，请客户按照页面提示填写：

1、项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式进行预提交；

2、提交项目所需要的具体信息：细胞样本、目标蛋白及对应的一抗等。

实验信息

实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告，检测结果可在线查看或打印，并永久保留。

实验周期

致电详询

实验交付内容

①荧光照片组合图;

②PLA信号统计结果;

③详细的实验结题报告。

我司案例

细胞样本蛋白A和蛋白B强互作检测

细胞样本蛋白A和蛋白B弱互作检测

细胞样本蛋白A和蛋白B互作线粒体定位

组织切片样本蛋白A和蛋白B互作检测

参考文献

Wang S, Yoo S H, Kim H, et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay[J]. Journal of visualized experiments: JoVE, 2015 (95): 52139.