背景说明

来自不同样品的同一肽段经iTRAQ/TMT试剂标记后具有相同的质量数，并在一级质谱检测（MS1）中表现为同一个质谱峰。当此质谱峰被选定进行碎裂后，在二级质谱检测（MS2）中，不同的报告基团被释放，它们各自的质谱峰的信号强弱，代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。iTRAQ/TMT定量蛋白组学研究因其测定精准度高适应样品种类多，目前已有很广泛的应用。

原理简介

iTRAQ技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。

iTRAQ技术采用4种或8种同位素编码的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，而后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量。将蛋白质裂解为肽段，然后用iTRAQ试剂进行差异标记。iTRAQ试剂包括3个部分：报告基团（report group）、平衡基团（balance group）和肽反应基团（amine-specific reactive group）。报告基团相对分子质量为113-121Da（无120），因此iTRAQ 试剂可同时标记8组样品。平衡基团相对分子质量为192-184Da（无185），使得八种iTRAQ试剂分子量均为305Da，保证标记的同一肽段m/z相同。肽反应基团将iTRAQ试剂与肽段上赖氨酸及N端氨基酸残基相连，在其上报告基团通过平衡基团与反应基团相连，形成等量异位标签。由于iTRAQ试剂是等量的，即不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测，分子量完全相同，用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子（precursor ion）进行碰撞诱导解离，产物离子通过第二级质谱进行分析。在二级质谱分析过程中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，产生低质荷比(m/z)的报告离子。由于二级质谱可分析相对分子质量相差1的报告基团，不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度。同时，多肽内的酰胺键断裂，形成一系列b离子和y离子，得到离子片段的质量数，通过数据库查询和比较，可以鉴定出相应的蛋白质前体。 

图 iTRAQ实验流程图

TMT技术采用2种、6种或10种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较2组、6组或10组不同样品中蛋白质的相对含量。

TMT标签由三部分组成：分子量报告子、分子量标准化部分和反应基团，形成2种、6种或10种相对分子质量均等量的异位标签。TMT试剂通过反应基团能够高效地标记酶解后的肽段。在一级质谱图中，分子量标准化部分使任何一种TMT试剂标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比。在串联质谱中，可剪切臂能够优先断裂以便释放分子量报告子。每个报告子都有各自独特的分子量，并且能够在MS/MS分析中反应出所标记的多肽的样品丰度，根据报告离子的信号强度值可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。

表 iTRAQ和TMT标签的差异

图 iTRAQ与TMT标签

服务内容及说明

适用场景

1、疾病标志物及药物作用靶点研究；

2、疾病发生发展过程分子机制研究；

3、模式动物生理病理机制研究；

4、化学或生物药物作用机理信号转导研究；

5、蛋白鉴定和定量；

6、差异蛋白的筛选和鉴定。

实验周期

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2、尽可能丰富的相关资料、文献。

实验信息

实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。

实验交付内容

1、所有实验的原始数据（包括实验过程、实验试剂与设备等）；

2、表观组学基础数据分析与差异数据分析（生物信息学分析）；

3、生物信息学分析内容包括：

（1）iTRAQ鉴定：包括鉴定结果统计、重复性分析、Unique肽段数分布、肽段长度分布、蛋白覆盖度分布；

（2）iTRAQ定量：包括定量信息统计、蛋白质丰度比（FC）分布、表达量层次聚类分析。