背景说明

真核生物的基因通常是由多个外显子（编码区）和内含子（非编码区）交替组成。剪接是一个复杂的过程，它会移除前体mRNA（pre-mRNA）中的内含子，连接外显子，最终形成成熟的mRNA，用于蛋白质翻译。错误的剪接会导致mRNA和蛋白质异常，与多种遗传疾病相关。剪接过程是由一种高分子量的剪接体介导完成的。剪接体是由U1、U2、U4、U5和U6五种小核糖核酸蛋白（Small nuclear ribonucleoprotein, snRNPs）和多种非snRNP蛋白质组成的一种复合体。snRNPs和其他复合体蛋白质相互作用，形成功能复杂的结构，确保剪接体能够正确地定位和识别剪接位点，完成剪接过程。

Pre-mRNA剪接的过程（Lee et al., 2015）

Pre-mRNA剪接的过程如下：

（1）U1 snRNP的识别：U1 snRNP与pre-mRNA的5'端外显子结合，并以ATP依赖性方式识别5'剪接位点。在这一过程中丝氨酸/精氨酸富集蛋白（Serine/Arginine-rich proteins, SR蛋白）与异质核核糖核蛋白（Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs）相互作用，SR蛋白识别并结合在外显子剪接增强子（Exonic splicing enhancer, ESE）上促进U1 snRNP识别5'剪接位点，而hnRNPs识别并结合在外显子剪接沉默子（Exonic splicing silencer, ESS）上阻碍U1 snRNP识别5'剪接位点。

（2）U2 snRNP的结合：U2 snRNP结合到内含子的分支位点形成剪接体前体。这是剪接的关键步骤，导致内含子的分离。

（3）U4/U5/U6 snRNP的组装：U4/U5/U6 snRNP与剪接体前体复合物相互作用组装成完整的剪接体。

（4）剪接体的催化活化：剪接体的催化活化通过两步酯交换反应完成。U2 snRNP招募十九号复合物（Nineteen Complex, NTC）和十九号复合物相关蛋白（Nineteen-Related Complex, NTR），进而释放U1和U4，然后打破剪接位点处的磷酸二酯键，产生两个相邻的外显子以及一个套索结构的内含子。

（5）剪接体的解除和剪接完成：内含子和snRNPs从剪接体复合物中释放出来，5'方向上的外显子攻击套索结构，去除内含子，并将相邻外显子连接起来完成剪接，最终生成成熟的mRNA。

Pre-mRNA选择性剪接指从一个前体mRNA分子中通过不同的剪接方式产生多个不同的成熟mRNA分子的过程。它不仅增加了基因表达的多样性，还参与了基因调控、发育和疾病等生物学过程。

选择性剪接的经典过程（McManus et al., 2011）

Pre-mRNA选择性剪接的几种方式如下：

Pre-mRNA选择性剪接（Blencowe et al., 2006）

单个碱基的改变（点突变）或更大的序列变化可以影响剪接信号，导致剪接错误。这些错误可能表现为外显子跳跃、内含子保留、替代剪接位点的使用等，进而影响蛋白质的功能。Minigene实验是一种用于研究基因剪接机制及其在疾病中作用的重要工具。这种实验方法是构建一个包含基因特定区域的小型基因（minigene），通常包括外显子、内含子和必要的剪接信号，然后将其插入到一个载体中，并转入细胞中进行表达。通过构建不同的minigene变异体，研究者可以探究特定序列如何影响剪接过程，包括剪接信号的识别、剪接复合物的组装等。minigene的主要实验流程如下：

（1）根据基因的突变位点，分析可能引起的发生剪接变化，在突变位点区域序列（含有几个外显子和内含子）构建minigene-mut质粒，以同区域的片段构建minigene-WT质粒；

（2）细胞转染；

（3）RT-PCR检测或测序分析剪接变化情况；

服务内容及说明

适用范围

研究基因表达调控，剪接因子功能等。

客户下单及项目信息填写

在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录，请客户按照页面提示填写：样本来源、检测指标、样本类型、检测方式等信息，检测试剂盒可选自行提供或我司提供。

实验信息

实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。

实验周期

致电详询

实验交付内容

1、所有实验的原始数据（如重组载体的图谱序列信息和注释信息等）；

2、菌检电泳图，测序结果；

3、具体实验报告。

应用案例展示

用BRCA1基因序列构建了野生型minigene-WT质粒以及13种突变型minigene-mut质粒，13种突变位点为：c.80+1G>A，c.132C>T,c.213-1G>A，c.670+1delG，c.670+16G>A，c.4185+1G>A，c.5075-1G>C，c.-19-22_19-21dupAT，c.302-15C>G，c.547+14delG，c.4676-20A>G，c.4987-21G>T，c.5278-14C>G。野生型WT质粒和突变型mut质粒将转染COS-7细胞，然后用RT-PCR，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。可以看到c.80+1G>A，c.132C>T,c.213-1G>A，c.670+1delG，c.670+16G>A，c.4185+1G>A，c.5075-1G>C，c.4676-20A>G产生了剪接的改变（可见条带），而突变型c.-19-22_19-21dupAT，c.302-15C>G，c.547+14delG，c.4987-21G>T，c.5278-14C>G未发生剪接变化。

通过构建minigene载体转染细胞后的剪接变化情况（Steffensen at al., 2014）

参考文献

Blencowe B J. Alternative splicing: new insights from global analyses[J]. Cell, 2006, 126(1): 37-47.

Lee Y, Rio D C. Mechanisms and regulation of alternative pre-mRNA splicing[J]. Annual review of biochemistry, 2015, 84(1): 291-323.

McManus C J, Graveley B R. RNA structure and the mechanisms of alternative splicing[J]. Current opinion in genetics & development, 2011, 21(4): 373-379.

Steffensen A Y, Dandanell M, Jønson L, et al. Functional characterization of BRCA1 gene variants by mini-gene splicing assay[J]. European Journal of Human Genetics, 2014, 22(12): 1362-1368.