背景说明

Cas9核酸酶和gRNA形成Cas9核糖核蛋白（RNP），其可以结合和切割全基因组环境中的特定DNA靶标。为了被RNP切割，靶标必须具有两个特定序列。首先，gRNA需要17-21个碱基的RNA与DNA同源性，这称为原型间隔物。其次，Cas9蛋白需要短的原间隔区相邻基序 （PAM）才能与靶 DNA 结合。如果存在连接tracrRNA，并且gRNA与基因组靶标之间存在足够的同源性，则RNP会切割靶DNA的两条链，从而在基因组中的这个精确位置创建DSB。

虽然细胞核中的功能性CRISPR是以RNP形式存在的，但CRISPR作为分子工具的元素却适用于各种传递方法。早期实验成功创建了一种嵌合单向导RNA（sgRNA），其将crRNA和 tracrRNA结合成一条RNA链，而不是自然界中发现的双链。这种sgRNA和Cas9 mRNA可以从单个质粒表达，用于直接转染或包装成颗粒进行慢病毒转导。或者，重组Cas9蛋白可以与合成的crRNA和tracrRNA结合，以创建RNP，用于转染或微注射到胚胎中。

图 CRISPR质粒递送与RNP介导细胞后的比较（Molinari et al., 2021）。

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实验周期

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实验交付内容

1、所有实验的原始数据（包括实验过程、实验试剂与设备等）；

2、后续所有实验的相关结果（靶点三包一至少有效果）。

参考文献

Molinari H B C, Vieira L R, SILVA N V, et al. CRISPR technology in plant genome editing: biotechnology applied to agriculture[J]. 2021.