背景说明
现有的基因编辑系统主要包括锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）系统、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）系统以及CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein）系统，其中，CRISPR/Cas系统由于载体构建过程简单、编辑效率高等优点，成为当前广泛应用的主流基因编辑系统。2020年，Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna两位科学家获得了诺贝尔化学奖，以表彰她们在“开发CRISPR/Cas基因组编辑方法”方面作出的贡献。
图 CRISPR/Cas9基因编辑工具的发展历程（Zhang H, et al. 2021）。
原理简介
CRISPR/Cas系统分为两大类五种类型（Ⅰ-Ⅴ），目前应用较广的CRISPR/Cas9系统为Ⅱ型CRISPR系统，仅需一个Cas蛋白和两个RNA元件即可实现对靶DNA的切割。为了进一步简化CRISPR/Cas9系统，通过保留必需元件tracrRNA和crRNA的核心序列并引入连接区，将两者合并为一个sgRNA（Single guide RNA），并通过体外实验证实Cas9蛋白能在sgRNA的引导下切割双链DNA，这一系列成果为CRISPR/Cas9在基因编辑中的广泛应用奠定了坚实基础。自2013年起，利用CRISPR/Cas9技术相继实现了对人类细胞、小鼠细胞、斑马鱼、果蝇、水稻、拟南芥等真核系统中的内源基因组编辑。
来源于链球菌Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白SpCas9最先被应用于基因编辑，该蛋白含有一个RuvC-like结构域和一个HNH核酸酶结构域，两者分别在靶DNA的PAM序列“NGG”上游3nt处对DNA双链进行切割，形成平末端。在真核系统中，需要在Cas9蛋白中添加一段核定位信号以保证该蛋白进入细胞核正常发挥功能。sgRNA是一段具有特定结构的单链RNA，其5’端约20个碱基与靶DNA互补配对结合，引导Cas9/sgRNA复合物对相应位点进行切割，决定编辑位点特异性。因此，在构建基因编辑载体编辑受体基因组中不同的位点时，只须改变sgRNA中5’端的特异位点识别序列，而其他元件可保持不变。此外，通过构建多个sgRNA表达盒的串联载体，可实现同时对多个靶位点的有效编辑，显著地提高该系统的编辑效率。在基因编辑载体构建完成后，体外导入细胞的有效方法有病毒感染和非病毒（电穿孔、核转染、显微注射或纳米颗粒）两种方法。
图 CRISPR/Cas9基因编辑系统机制（Zhang H, et al. 2021）。
我司载体介绍
我司基因编辑载体大多采用商品化载体，部分载体为我司改造。我司可针对您的目的基因序列，分析序列的各项参数后，设计引物后扩增预期片段，连入原始载体骨架，得到重组载体。
我司原始细胞基因编辑载体列表，可根据不同的需求，选择不同的载体，插入不同的位置
服务流程
客户在线下单——订单/实验材料确认——CloneCAD实验设计——基因编辑载体构建——可选后续实验（包括：细胞转染/感染、体内注射、功能研究等等）——结果交付
服务内容及说明
适用范围
1、功能基因的敲除/敲入；
2、非编码区的编辑，例如对启动子、microRNA、lncRNA、circRNA的基因序列进行编辑；
3、单碱基编辑（敲除/敲入）、精准碱基编辑；
4、非同源/同源多基因敲除、代谢通路多基因敲除；
5、大片段删除；
6、基因定点突变/修饰。
客户下单及项目信息填写
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录，请客户按照页面提示填写：目的基因信息、载体构建详情，后续转染的细胞可选自行提供或我司提供。
实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。
实验周期
致电详询
实验交付内容
1、所有实验的原始数据（包括实验过程、实验试剂与设备等）；
2、重组过表达载体：一份质粒、一份大肠杆菌菌液（25%甘油菌）；
3、重组载体的全序列信息和注释信息；
4、重组载体的酶切图谱；
5、重组载体测序结果；
6、后续所有实验的相关结果（靶点三包一至少有效果）。
案例展示
图 我司HeLa细胞中xx基因单靶点与双靶点敲除检测示意图
参考文献
Zhang H, Qin C, An C, et al. Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer. Mol Cancer. 2021;20(1):126.
